Sekundære bindings-sites på byg a-amylases overflade er karakteriseret vha. »site-directed« mutagenese og kulhydrat affinitetsmålinger. Forsøgene bekræfter, at byg a-amylases overflade-sites er vigtige for substratkontakten. Resultaterne baner vej for udvikling af mere effektive amylaser til modificering eller forflydning af stivelse ved f.eks. bagning og produktion af glucosesirup.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 9, 2006. Teksten kan desuden læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Morten Munch Nielsen1, Sophie Bozonnet1,2, Vibeke Barkholt1 og Birte Svensson1 Biochemistry and Nutrition Group, BioCentrum-DTU, DTU 2Ny adresse: Laboratoire Analyse et Environnement, Université d’Evry-Val d’Essone, Evry, Frankrig
Kulhydratomdannende enzymer indeholder ofte særlige kulhydratbindende moduler (domæner) eller har sekundære kulhydrat bindings-sites, der fremmer reaktionen med makromolekylære substrater, f.eks. stivelse eller cellulose. Stivelse findes i naturen som semi-krystallinske partikler (stivelseskorn) opbygget af tætpakkede polysaccharidmolekyler, der vanskeligt angribes af enzymer. Sekundære bindings-sites og kulhydratbindende moduler virker dels ved at hæfte enzymet til substratoverfladen, så den lokale koncentration og kontaktperioden forøges, dels ved at vriste de enkelte polysaccharidkæder fra hinanden, så de bliver tilgængelige for enzymangreb [1,2].
Vi har vha. kemisk mærkning og røntgenkrystallografi identificeret to sekundære bindings-sites i byg a-amylase. For at afdække deres rolle i stivelsesnedbrydning er aminosyrerester i disse sites udskiftet ved »site-directed« mutagenese. Derefter har vi målt enzymmutanternes evne til at binde stivelse og b-cyclodextrin, der betragtes som en model for stivelse.
Stivelses-struktur
Stivelse findes i almindelige fødevarer som brød, kartofler, ris og pasta og er et vigtigt næringsstof for mange dyr og mikroorganismer. Det syntetiseres i planter fra glucose via sucrose og oplagres i frø og rodknolde som mikroskopiske stivelseskorn (figur 1A), der mobiliseres ved spiring. Stivelseskorn består af polysacchariderne amylose og amylopektin. Amylose, der udgør 20-25%, er en lineær polymer af a-1,4-bundne glucoserester med molmasse 1´105-1´106 og polymeriseringsgrad (DP) 600-6000 [3]. Amylopektin er med en molmasse på 1´107-1´109 og DP 6´104-6´106 [3] blandt de største molekyler i naturen. Det indeholder 95% a-1,4- og 5% a-1,6-bundne glucoserester, hvoraf de sidstnævnte udgør forgreningspunkter (figur 1C, D). I stivelseskorn alternerer krystallinske og amorfe lag (figur 1B). De krystallinske lag består af tætpakkede dobbeltspiraler (figur 1D) dannet af forholdsvis korte parallelle forgrenede kæder i amylopektin [3] (figur 1E). Ved syre- eller enzymkatalyseret hydrolyse nedbrydes de amorfe områder hurtigt, hvorefter man tydeligt kan se de krystallinske lag med elektronmikroskopi.
Amylaser i malt
En række enzymer samarbejder i naturen om at nedbryde stivelse til glucose, der er den vigtigste energi- og kulstofkilde for de allerfleste organismer.
a-Amylaser (a-1,4-D-glucan glucanohydrolase, EC 3.2.1.1) er endohydrolaser, der katalyserer spaltning af interne a-1,4-O-glucosidbindinger i amylose og amylopektin samt i glykogen og lignende poly- og oligosaccharider.
a-Amylaser, der er vidt udbredt i planter, dyr og mikroorganismer, grupperes pga. aminosyresekvenslighed sammen med a-glucosidhydrolaser og transglucosidaser i glycosidhydrolase familie 13 (GH-13), der omfatter flere end 2500 sekvenser ( http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/ ) [4].
Byg (Hordeum vulgare) er Danmarks mest almindelige kornafgrøde (26% af det samlede dyrkede areal i 2004)1. Hovedparten bruges til foder, mens 20% er maltbyg til ølfremstilling. Når byg spires til malt ved at hæve temperatur og fugtighed, udskiller kimen plantehormonet gibberillinsyre.
Gibberillinsyre aktiverer gener i aleuronlaget bl.a. for to a-amylaser (AMY1 og AMY2), der angriber frøhvidens lagerstivelse (figur 2). a-Amylaserne hydrolyserer sammen med tre andre maltenzymer stivelse til glucose og maltose, der efterfølgende fermenteres til alkohol. AMY1 og AMY2 består begge af en polypeptidkæde med ca. 400 aminosyrer. Selvom omtrent 80% af aminosyresekvensen er ens, adskiller isoenzymernes egenskaber sig klart fra hinanden:
– AMY1 har højere affinitet for Ca2+-ioner, bedre stabilitet ved svagt surt pH, lavere varmestabilitet og den højeste affinitet over for forskellige substrater. AMY1 er desuden mest effektiv ved hydrolyse af stivelseskorn.
– AMY2 har højest aktivitet over for opløselige substrater og kun AMY2 hæmmes af frøets egen byg a-amylase/subtilisin inhibitor (BASI).
Struktur af AMY1 og AMY2
Begge byg a-amylasernes tredimensionale struktur er bestemt ved røntgenkrystallografi (figur 3A). De er opbygget som andre a-amylaser med tre domæner A, B og C [5;6], hvoraf A – en såkaldt (b/a)8-tønde – indeholder det katalytiske site med tre syregrupper, asparaginsyreresterne Asp180 og Asp291 og glutaminsyreresten Glu205 (AMY1-nummerering) [5,6]. Domæne A og B danner sammen en lang kløft med en række subsites, der hver binder en glucoserest fra substratmolekylet. Domæne B indeholder tre Ca2+-ioner, hvoraf én er bevaret i alle a-amylasestrukturer. Ca2+-ioner påvirker AMY1’s og AMY2’s stabilitet og enzymaktivitet forskelligt. Derfor undersøges det strukturelle grundlag for hver enkelt Ca2+-ions rolle i et andet projekt. Indtil for nylig var domæne C’s funktion ukendt for byg a-amylaser og alle andre »familie 13 enzymer«. Imidlertid viser nogle af vores seneste resultater, at domæne C er vigtigt for enzymets evne til at binde sig til stivelse.
Sekundære bindings-sites i AMY1 og AMY2
På AMY1’s overflade er der uden for kløften med det katalytiske site identificeret to kulhydrat-bindings-sites. Begge sites kan ses i krystalstrukturer af AMY1 i kompleks med den ikke-hæmmende substratanalog methyl 4I,4II,4III-trithiomaltotetraose (thio-DP4) og en katalytisk inaktiv mutant Asp180®Ala AMY1 i kompleks med substratet maltoheptaose (figur 3A) eller pseudotetrasaccharidet acarbose, der er en hæmmer og maltotetraoseanalog (figur 3B) [5;7]. I overflade-sites kan aromatiske aminosyrer (tyrosin og tryptofan) »stacke« til kulhydrat ved vekselvirkning mellem de aromatiske sidekæders p-orbital og hydrofobe områder af glucoseringen. Disse og andre aminosyresidekæder kan desuden hydrogenbinde til hydroxylgrupper i kulhydratet.
Det stivelseskornbindende overflade-site
Det første overflade-site blev identificeret i en a-amylase i midten af firserne ved at oxidere tryptofansidekæders indolring i AMY2 med N-bromsuccinimid. Derefter fulgte en aminosyresekvensbestemmelse af, hvilke tryptofaner b-cyclodextrin beskyttede mod oxidationen [8]. Da b-cyclodextrin konkurrerer med stivelseskorn om binding til AMY2, blev sitet døbt »det stivelseskornbindende overflade-site« (»starch granule binding surface site«). Det viste sig senere at binde acarbose i AMY2’s krystalstruktur [6]. I AMY1 »stacker« de samme Trp278 og Trp279 med to glucoseringe i forskellige bundne oligosaccharider (figur 3A).
Sukkertangen
Det andet overflade-site blev for nylig opdaget i domæne C i AMY1’s krystalstruktur [5]. Den centrale tyrosinrest, Tyr380, indgår med 8 af de 17 intermolekylære hydrogenbindings- og van der Waals kontakter til thio-DP4 (substratanalog). Tyr380 sidder i et bevægeligt loop, og sidekæden svinger adskillige ångstrøm, når den »griber om sukkeret«. Sitet kaldes derfor en sukkertang (»a pair of sugar tongs«). Det er det først beskrevne af sin art og den første indikation af en funktion [5] for domæne C i glycosidhydrolase 13 familien. Til trods for, at AMY2 har den tilsvarende Tyr378 (AMY2-nummerering), er binding til sukkertangen kun set for AMY1 [5]. Den mest iøjnefaldende forskel i denne del af strukturen er AMY2’s prolinrest (Pro276), der svarer til en serinrest (Ser378) i AMY1. Aminosyren prolin nedsætter generelt peptidkædens fleksibilitet og er måske grunden til, at Tyr378-loopet i AMY2 ikke reagerer som sukkertangen i AMY1.
»Site-directed« mutagenese af sekundære bindings-sites i AMY1
Det er ukendt, hvordan overflade-sites’ene medvirker ved byg a-amylasers hydrolyse af stivelse. For at undersøge dette er de aromatiske aminosyrer Trp278, Trp279 og Tyr380 i AMY1 udskiftet med den lille alifatiske aminosyre alanin. Desuden er mutanten Ser378®Pro AMY1 fremstillet for at efterligne AMY2’s struktur. AMY1-mutanterne fremstilles i gæren Pichia pastoris [9] ved transformation med mutantgener, hvis DNA-sekvens er ændret ved »site-directed« mutagenese. Når methanol tilsættes som kulstofkilde, udskiller den enkelte Pichia-transformant det tilsvarende mutantgenprodukt, dvs. mutantenzym, som oprenses fra kulturvæsken ved ultrafiltrering og ionbytterkromatografi, da flere af sukkertang-strukturændringerne var uforenelige med affinitetsoprensning på b-cyclodextrin-konjugeret Sepharose.
Enzymmutanternes affinitet for b-cyclodextrin (figur 4A) måles ved »surface plasmon resonance«-analyse (BIAcore) (tabel 1). Først biotinyleres proteinet, og dernæst bindes det på en streptavidin-coated chip, der eksponeres for b-cyclodextrinopløsninger af forskellig koncentration (figur 4B). Fra de målte response units (figur 4C), som angiver massetilvæksten til chippen, bestemmes dissociationskonstanten (KD).
KD var 1,4 mM for Tyr380®Ala AMY1, hvilket svarer til syv gange svækket affinitet ift. AMY1 (tabel 1). Tyr380 er derfor nødvendig for normal binding, hvilket er i god overensstemmelse med sidekædens og kulhydratmolekylets tætte indbyrdes kontakt [5].
Desuden bestemmes affiniteten for stivelseskorn ved måling af fordelingen af enzym i opløsning og bundet til stivelseskorn. Tyr380®Ala mutanten bandt 16 gange svagere, men Ser378®Pro mutanten havde samme affinitet som AMY1 for stivelseskorn. Det er derfor ikke kun Pro376, der er årsagen til AMY2’s svagere binding af stivelse og b-cyclodextrin.
Tryptofan Trp279 i domæne A’s overflade-site var med i den første serie af AMY1-mutanter, der også omfattede de katalytiske grupper [10]. Desværre gav den tidligere benyttede værtsorganisme Saccharomyces cerevisiae 50-104 mindre udbytte af rekombinant enzym end P. pastoris, og der blev kun opnået en meget lille mængde Trp279®Ala AMY1, som dog viste sig at have svækket binding til stivelseskorn og b-cyclodextrin [10].
Enzymatisk hydrolyse af amylose og af oligosaccharidet 2-chlor-4-nitrophenyl b-D-maltoheptaosid (Cl-pNPG7) påvirkedes af Tyr380®Ala mutationen (tabel 1). Tyr380 har således en vis indflydelse på den katalytiske aktivitet, hvilket peger på et samspil mellem overflade-sitet og det aktive site. Dette vil blive undersøgt nærmere, da Tyr380®Ala og Ser378®Pro AMY1 for nylig er blevet krystalliseret [11]. I lyset af den nyeste viden om forekomst og betydning af overflade-bindings-sites i a-amylaser har vi fremstillet Trp278®Ala, Trp279®Ala og dobbeltmutanten Trp278®Ala/Trp279®Ala samt kombinationer med mutationer i såvel sukkertangen som i det aktive site. Affiniteten af disse AMY1-mutanter karakteriseres for tiden, og flere krystalstrukturer er ved at blive opklaret.
Introduktion af ekstra kulhydrat bindings-sites
De beskrevne mutanter belyser gennem tab af kulhydratbinding de to sekundære sites’ egenskaber. Omvendt er det vist, at vi kan fremstille a-amylaser med forbedret bindingsevne ved at tilføre ekstra kulhydratbindende sites [12]. Flere glycosidhydrolaser er fra naturens side udstyret med særlige kulhydratbindende moduler [13], der især er effektive ved omdannelse af uopløselige substrater f.eks. stivelseskorn og cellulosefibre.
Vha. gensplejsning er AMY1’s C-terminal koblet til N-terminalen af det kulhydratbindende modul SBD (»starch binding domain«) fra Aspergillus niger glucoamylase, der har to kulhydrat bindings-sites [14]. Fusionsproteinet AMY1-SBD hydrolyserede stivelseskorn fra byg eller kartofler med op til 15 gange AMY1’s egen hastighed. AMY1-SBD bandt også seks gange stærkere til stivelseskorn end AMY1, hvilket stemmer fint med den forøgede enzymatiske nedbrydning af stivelse, mens der ikke var nogen forskel på AMY1-SBD og AMY1’s hydrolytiske aktivitet for oligosaccharidsubstrater.
Konklusion
Den indledende karakterisering af AMY1’s sukkertang forbedrer forståelsen af, hvordan sekundære bindings-sites vekselvirker med substrat og muligvis samarbejder med det aktive site. Sukkertang – dvs. Tyr380-mutanternes tab af bindings- og hydrolyseevne over for stivelseskorn (ikke-publicerede resultater, S. Bozonnet m.fl.) er bekræftet af de tilsvarende krystalstrukturer i kompleks med forskellige kulhydrater.
Perspektivet er at kunne indføre lignende overflade-sites i andre stivelsesnedbrydende enzymer, eventuelt i kombination med fusion til stivelsesbindende moduler, og dermed forøge den enzymatiske aktivitet.
Det vil i den nærmeste fremtid blive undersøgt, om de to overflade-sites deltager i en særlig reaktionsform kaldet »multiple attack«, hvor AMY1 eller AMY2 i kompleks med polysaccharidsubstrat hydrolyserer flere end en enkelt glucosidbinding før enzym-substratkomplekset dissocierer. Det antages, at substratmolekylet, efter at det første produkt er frigjort, skubbes i stilling i det katalytiske site til det næste angreb, muligvis ved medvirken af sekundære bindings-sites.
Det forventes, at »protein engineering« også kan optimere enzymer rettet mod andre kulhydrater end stivelse ved at indføre særlige kulhydratbindende overflade-sites eller moduler, der fremmer funktionen over for polymere substrater.
Tak til EU-projektet CEGLYC og Forskningsrådet for Natur og Univers for økonomisk støtte samt til DTU for et ph.d.-stipendium (MMN).
Referencer
1. Morris,V.J., Gunning,A.P., Faulds,C.B., Williamson,G., & Svensson,B. (2005) AFM images of complexes between amylose and Aspergillus niger glucoamylase mutants, native, and mutant starch binding domains: A model for the action of glucoamylase. Starch-Stärke 57, 1-7.
2. Southall,S.M., Simpson,P.J., Gilbert,H.J., Williamson,G., & Williamson,M.P. (1999) The starch-binding domain from glucoamylase disrupts the structure of starch. FEBS Letters 447, 58-60.
3. Tester,R.F., Karkalas,J., & Qi,X. (2004) Starch – composition, fine structure and architecture. Journal of Cereal Science 39, 151-165.
4. Coutinho,P.M. & Henrissat,B. (1999) Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. In Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering (Gilbert,H.J., Davies,G., Henrissat,B., & Svensson,B., eds), pp. 3-12. The Royal Society of Chemistry, Cambridge.
5. Robert,X., Haser,R., Gottschalk,T.E., Ratajczak,F., Driguez,H., Svensson,B., & Aghajari,N. (2003) The structure of barley alpha-amylase isozyme 1 reveals a novel role of domain C in substrate recognition and binding: A pair of sugar tongs. Structure 11, 973-984.
6. Kadziola,A., Søgaard,M., Svensson,B., & Haser,R. (1998) Molecular structure of a barley alpha-amylase-inhibitor complex: Implications for starch binding and catalysis. Journal of Molecular Biology 278, 205-217.
7. Robert,X., Haser,R., Mori,H., Svensson,B., & Aghajari,N. (2005) Oligosaccharide binding to barley alpha-amylase 1. Journal of Biological Chemistry 280, 32968-32978.
8. Gibson,R.M. & Svensson,B. (1987) Identification of tryptophanyl residues involved in binding of carbohydrate ligands to barley alpha-amylase 2. Carlsberg Research Communications 52, 373-379.
9. Juge,N., Andersen,J.S., Tull,D., Roepstorff,P., & Svensson,B. (1996) Overexpression, purification, and characterization of recombinant barley alpha-amylases 1 and 2 secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Protein Expression and Purification 8, 204-214.
10. Søgaard,M., Kadziola,A., Haser,R., & Svensson,B. (1993) Site-directed mutagenesis of histidine-93, aspartic acid-180, glutamic acid-205, histidine-290, and aspartic acid-291 at the active-site and tryptophan-279 at the raw starch binding-site in barley alpha-amylase 1. Journal of Biological Chemistry 268, 22480-22484.
11. Tranier,S., Deville,K., Robert,X., Bozonnet,S., Haser,R., Svensson,B., & Aghajari,N. (2005) Insights into the »pair of sugar tongs« surface bindingsite in barley alpha-amylase isozymes and crystallization of appropriate sugar tongs mutants. Biologia 60, 37-46.
12. Juge,N., Nøhr,J., Le Gal-Coëffet,M.F., Kramhøft,B., Furniss,C.S.M., Planchot,V., Archer,D.B., Williamson,G., & Svensson,B. (2006) The activity of barley alpha-amylase on starch granules is enchanced by fusion of a starch binding domain from Aspergillus niger glucoamylase. Biochimica et Biophysica Acta 1764, 275-284.
13. Boraston,A.B., Bolam,D.N., Gilbert,H.J., & Davies,G.J. (2004) Carbohydrate-binding modules: fine-tuning polysaccharide recognition. Biochemical Journal 382, 769-781.
14. Sorimachi,K., LeGalCoeffet,M.F., Williamson,G., Archer,D.B., & Williamson,M.P. (1997) Solution structure of the granular starch binding domain of Aspergillus niger glucoamylase bound to beta-cyclodextrin. Structure 5, 647-661.
15. Mori,H., Sass Bak-Jensen,K., Gottschalk,T.E., Motawia,S.M., Damager,I., Lindberg Møller,B., & Svensson,B. (2001) Modulation of activity and substrate binding modes by mutation of single and double subsites +1/+2 and -5/-6 of barley alpha-amylase 1. European Journal of Biochemistry 268, 6545-6558.
Figur 1. A-B) Stivelse findes som mikroskopiske stivelseskorn opbygget af skiftevis krystallinske og amorfe lag. C-D) Amylopektin er blandt de største molekyler i naturen og indeholder forgreninger. De krystallinske lag består af dobbeltspiraler, dannet af parallelle, korte forgrenede kæder. E) Den kemiske struktur af et forgreningspunkt (a-1,6-O-glucosidbinding).
Figur 2. Spiringen igangsættes ved en forøgelse af temperatur og fugtighed, hvorved frøkimen udskiller plantehormonet gibberellinsyre, som i aleuronlagets celler aktiverer produktionen af enzymer, heriblandt a-amylase 1 og 2, der i fællesskab med andre maltenzymer nedbryder frøhvidens lagerstivelse til maltose og glucose. Frøhviden indeholder foruden stivelse, proteiner og lipider, der forsyner kimen med næringsstoffer, indtil den ny plante har etableret sit rodnet og de første kimblade.
Figur 3.
A) Krystalstruktur af komplekset mellem den katalytisk inaktive mutant af byg a-amylase 1, Asp180®Ala AMY1, og maltoheptaose, der udfylder syv subsites i substratbindingskløften mod den ikke-reducerende ende startende fra det katalytiske site (med de tre katalytiske grupper Ala180, Asp291, Glu205 markeret med lyserødt) [7]. Ud over substratbindingskløften har AMY1 to sekundære overflade-bindings-sites: »det stivelseskornbindende overflade-site« karakteriseret ved Trp278 og Trp279 (markeret med rødt; til venstre) og »sukkertangen«, der indeholder Tyr380 (markeret med rødt; nederst).
B) Den kemiske struktur af: 1) maltoheptaose (substrat), 2) methyl 4I,4II,4III-trithiomaltotetraose (thio-DP4, substratanalog) og 3) acarbose (a-amylaseinhibitor).
Figur 4. Bindingsanalyse for b-cyclodextrin og AMY1 ved surface plasmon resonance (SPR). Sukkertang-mutanternes affinitet for b-cyclodextrin (A) er bestemt ved immobilisering af de biotinylerede enzymer på streptavidin chips (B). KD beregnes fra plots af response units mod b-cyclodextrinkoncentrationen (C) (se tabel 1).
