Den bedste måde at beskrive arbejdsområdet for ”bio-kemiingeniøren” er gennem eksempler. I det følgende vil jeg vise, hvordan, efter min mening, kombinationen af de to, tilsyneladende forskellige discipliner, bedst fungerer.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 11, 2015 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder.
Af John Villadsen, Institut for Kemiteknik, DTU
Den gode ”bio-kemiingeniør” har erhvervet kendskab til væsentlige dele af disciplinerne biokemi og biologi, og han/hun kan anvende kernediscipliner fra kemiingeniøruddannelsen – fysisk kemi, reaktionslære, katalyse, fysiske transportprocesser – til at løse problemer med oprindelse i biovidenskaberne. Uden et solidt kendskab til biokemi og biologi bliver modelleringsarbejdet nytteløst, men forståelse af detaljer i metabolismen såsom navne på enkelte metabolitter betyder mindre, end hvorfor og hvordan metabolismen fungerer. Man skal være idérig og ved modelarbejde og eksperimenter turde undersøge andre løsninger end de gængse, for herigennem at opnå væsentlige besparelser i industrielle processer, både med hensyn til udbyttet og til driftsomkostninger. Det sidste er et kendetegn for den gode kemiingeniør.
Støkiometri
Bio-reaktioner, altså omdannelse af reaktanter (”substrater”) til produkter, beskrives ligesom ”almindelige” kemiske reaktioner ved en støkiometri. I slutningen af 90’erne blev støkiometrien (1) udviklet af Genencor for DuPont’s produktion af 1,3 propandiol (C3H8O2) som en af de to komponenter i polyesteren Sonora™, den måske største nyskabelse hos DuPont siden opfindelsen af Nylon:
(1)
Substraterne er glukose, ilt og ammoniumioner (her skrevet som NH3). Produkterne er biomasse, propandiol, samt CO2 og (en ubetydelig mængde) H2O. Støkiometrien er normeret til ét C-atom glukose og 0.120 + 0.543 + 0.337 = 1. Udover at C-balancen stemmer, gælder det også for den såkaldte redox-balance, der beskriver, hvordan redox-ækvivalenter overføres mellem substrater og produkter.
Man definerer enheden for redox ved at tildele brintatomet redox-niveauet 1. Samtidig definerer man for hvert grundstof et redox-neutralt stof. Det simpleste valg er [H2O, CO2, NH3], idet disse ofte forekommer i fermenterings-støkiometrier. Herved fås redoxniveauet for [O, C, N] som [-2, 4, -3]. Nu kan redoxindholdet af hver af reaktanterne i (1), nemt beregnes:
[glukose = 4 (per C-atom), biomasse (indholdet af H, O og N per C-atom fundet ved elementaranalyse) = 4.20, propandiol per C-atom = 16/3, og O2 = – 4].
Redoxbalancen for (1):
4 + 0.15∙ (-4) = 0.120∙4.20 + 0.543∙16/3 ses at stemme, idet NH3, CO2 og H2O er redox-neutrale og ikke bidrager til balancen.
Den vigtigste parameter for procesøkonomien er udbyttet af det ønskede produkt, her 1,3 propandiol, på kultofkilden.
Ysp = 0.543 C-atom propandiol/C-atom glukose = 0.543∙25.33/30 = 0.458 kg/kg.
Ysp ∙YPsp, altså kulstofudbyttet ganget med forholdet mellem prisen på 1,3 propandiol og glukose skal være væsentlig større end 1 for, at processen kan være økonomisk attraktiv.
For Dupont ville fortjenesten ved processen (1) være 0.458∙1.5/0.4 = 1.72 US$ per kg forbrugt glukose, en ikke imponerende fortjeneste, når de betydelige anlægsomkostninger tages i betragtning.
Et vigtigt begreb for beregning af økonomisk bæredygtighed er det maksimale udbytte Yspmax. For processer, hvor substratet har mindre redoxindhold per C-atom end det ønskede produkt, er det bedst, hvis sideproduktet ikke indeholder redox, dvs. sideproduktet er alene CO2. Når substratet er mere reduceret end det ønskede produkt, kan man endda optage CO2. Dette illustreres i følgende eksempler:
(2 a)
(2 b)
(2 c)
(2 d)
(2 a) er den velkendte produktion af ethanol fra glukose, hvor Yspmax = 2/3 C-atom/C-atom = 0.51 kg/kg.
(2 b) viser, at udbyttet i (1) er langt fra det maksimalt mulige, nemlig 0.75 C-atom/C-atom.
Produktion af ravsyre med lavere reduktionsgrad (3.5) end glukose (2 c) muliggør et udbytte >1 ved optagelse af CO2 fra omgivelserne. Når slutproduktet i (2 d) er 1,4 butandiol med en reduktionsgrad på 22/3 per C-atom, medfører det et tab af glukose til CO2, og udbyttet er meget mindre end for ravsyre.
Enhver empirisk fundet støkiometri som (1) kan spaltes op i tre støkiometrier:
(3 a)
(3 b)
(3 c)
(3 a) er den ønskede reaktion, der omdanner glukose til 1,3 propandiol med Yspmax = 3/4
(3 b) er produktion af biomasse, der er nødvendig for at udnytte cellens metabolske netværk til at danne det ønskede produkt.
Jeg har valgt en støkiometri for aerob dannelse af bagegær fra sukker, men andre organismer, for eksempel mælkesyrebakterier og E. coli følger omtrent samme støkiometri.
(3 c) illustrerer et nødvendigt forbrug af glukose, der ved ”forbrænding” giver energi til at holde koncentrationen af levende celler på et konstant niveau. Dette kaldes en ”maintenance”-reaktion.
Hvis hastigheden af reaktion (3a) defineres til at være 1, mens (3 b) og (3 c) har hastighederne hhv. α og β, får man 0.75 C-atom 1,3 propandiol ved at bruge (1 + α + β) C-atomer glukose. Med dette forbrug af glukose får man 0.5959∙α C-mol biomasse. Dette giver:
(1 + α + β) ∙ 0.543 = 0.75, og 0.5959 α = (1 + α + β) ∙ 0.120 → (1 + α + β) = 1.381, α = 0.278 og endelig
β = 0.103.
0.278/1.381 = 20% af det totale glukoseforbrug går til at danne biomasse, mens vedligeholdelse (”maintenance”) af biomassen kræver 7.3% af det totale glukoseforbrug.
Mens ”maintenance”-sukkerforbruget er af en passende (lille) størrelse er det påfaldende, at alt for meget sukker går til at danne biomasse. Analysen giver følgende vejledning til molekylærbiologerne:
Man bør formindske glukosestrømmen (”fluxen”) til de metabolske veje (”pathways”), der fører til biomasse, og samtidig øge fluxen i den reducerende pathway, der fører til 1,3 propandiol.
Dette kan ske ved at øge enzymniveauet i vejen hen mod 1,3 propandiol, sådan at glukose transporteres hurtigere gennem denne pathway. Samtidig kan enzymniveauet i vejen mod biomasse formindskes.
Eksemplet viser, hvordan en simpel modelanalyse kan føre til en større forståelse af totalreaktionen, og dermed vejlede molekylærbiologerne til at fremstille en forbedret produktionsorganisme.
Den næste generation af E. coli-produktionsorganismen forøgede Ysp til 0.685, og den endelige organisme, brugt i et 150000 t/år produktionsanlæg i Tennessee har Ysp = 0.71, i sandhed en imponerende forbedring.
Ravsyre (1,4 butandisyre) og 1,4 butandiol
Fremstilling af propandiol fra glukose kan nemt beskrives som en metabolsk graf, med fructose-1,6-diphosphat som knudepunkt. Her deles strømmen i to grene. Èn, der fører til 1,3 propandiol via glycerol, og én til pyruvat, der efterhånden fører til mange metabolske produkter og biomasse. Netværket, der fører til ravsyre (SA) og 1,4 butandiol (BDO), (2 c) og (2 d), er langt fra så simpelt. Dicarboxylsyrer (og en række andre vigtige produkter) dannes i TCA(tricarboxyl)-cyklen, figur 1.
Når r_reductive/r_█(oxidative@) = 5, som beskrevet ovenfor bliver Ysp = 8/7 det maximale udbytte ifølge (2c). Det samme resultat opnås, når citrat spaltes til SA + glyoxylat, hvor glyoxylat sammen med et ekstra AcCoA danner malat, der reduceres til SA. Man kan således i TCA-cyklen opnå det maksimale SA-udbytte.
Det kan også opnås, når BDO er slutproduktet, men Yspmax er kun 8/(11 ) og r_reductive/r_█(oxidative@) falder drastisk fra 5 til 4/9.
En organisme udviklet til produktion af SA kan kun efter en stor ombygning bruges til BDO-produktion.
Endnu værre: Organismen må nødvendigvis producere biomasse for at kunne fungere i længere tid. Dræn af kulstof til byggesten for biomasse eller af redox (NADH) til produktion af biprodukter vil reducere BDO-udbyttet relativt mere, end hvis SA er det ønskede produkt.
Den nyeste litteratur viser mange eksempler på, at indsættelse af gener for produktion af nogle få enzymer muliggør, at slutproduktet fra en veletableret pathway kan omdannes til et andet, mere attraktivt slutprodukt. For eksempel kan lysin (C6H14N2O2) simpelt decarboxyleres til cadaverin (1,5 diaminopentan, C5H14N2), et værdifuldt substrat til fremstilling af polyamider, og da lysin produceres (til foder) i en kvantitet på over 106 ton per år er det meget attraktivt at benytte en svagt modificeret produktionsorganisme for lysin til formålet.
Den meget dårlige støkiometri for fremstilling af BDO fra sukker i forhold til SA-støkiometrien rejser tvivl om det hensigtsmæssige i altid at gennemføre alle trin i syntesen af slutproduktet ved fermentering.
Firmaet Genomatica (San Diego, USA) har patenteret en 5-trins syntesevej fra Succinyl-CoA, se figur 1 og α-ketoglutarat til BDO. Denne helt bio-baserede produktionsproces er udliciteret til BASF, der interessant nok var det første selskab, der ad kemisk vej (startende med acetylen) producerede BDO – en proces, der stadig eksisterer, nu udført ved hydroformulering af allylalkohol. Det canadiske firma Bio Amber producerer også BDO, men stopper fermenteringsvejen ved SA, der i øvrigt produceres med en gær udviklet af Cargill i USA. Det med højt udbytte Ysp~1 kg/kg sukker fremstillede SA hydrogeneres til BDO + tetrahydrofuran (der også anvendes i polymerindustrien) ved en rent kemisk proces. Det synes som om, Bio Ambers procesen både er simplere og giver et højere udbytte af BDO.
Valg af produktionsorganisme
Valg af produktionsorganisme kan også være af afgørende betydning for, hvor konkurrencedygtig processen bliver. I løbet af de sidste 10 år er omtrent 15 betydelige bio-virksomheder gået ind i en industriel produktion af SA, og den totale produktion er øget fra omkring 50.000 til næsten 200.000 t SA/år. De fleste bruger bakterier som produktionsorganisme (sikkert fordi flertallet af videnskabelige artikler om SA-produktion benytter forskellige SA-producerende bakterier), men efterhånden har man øget produktiviteten af processer baseret på gær så meget, at disse er blevet fuldt konkurrencedygtige med hensyn til fermenteringsprocessen. En SA-proces baseret på gær har den konkurrencefordel, at den kan finde sted ved et ret lavt pH (4-5), hvor processer baserede på bakterier kræver, at pH > 6.5. Dette forklares nærmere herunder.
Da det af polymerindustrien ønskede SA skal være et rent krystallinsk pulver, nytter det ikke meget at tilbyde krystallinsk Na2SA, det salt man får, når begge syregrupper er ioniserede. I litteraturen beskrives adskillige processer, hvor syren fremstilles ud fra Na-saltet, men de medfører alle stærkt forøgede produktionsomkostninger.
Det danske firma Jurag foreslår en proces, hvor man først i en elektrokemisk drevet membranproces opkoncentrerer Na-saltopløsningen fra ca. 70 g/l til 180 g/l, og derefter med en proces baseret på bipolare membraner omdanner saltet til syren, der let udkrystalliseres ved 2-5°C. Men udgifterne til membranerne og til elektrisk energi er meget høje.
Man kan også i forskellige processer få syren ved tilsætning af H2SO4 til Na2SA, men denne fremgangsmåde forøger kemikalieudgifterne og giver store mængder affaldsprodukter (CaSO4).
De virksomheder, hvor gær bruges som produktionsorganisme har betydelige konkurrencefordele. Således producerede DSM og Roquette allerede i 2012 10.000 t/år (senere udvidet til 20.000 t/år) i et anlæg i Italien, mens Bio Amber og Mitsui siden 2014 producerer 30.000 t/år i Sarnia (Canada).
I 2015 startes et endnu større anlæg i Thailand, hvor 65.000 t/år skal produceres ved Bio Amber-processen, og hvoraf 50.000 t/år SA skal konverteres til BDO [3].
Fremstilling af foderprotein
I en helt anden industri, nemlig fremstilling af foderprotein (”Single Cell Protein”, SCP) ved fermentering af de efterhånden meget billige substrater methan og methanol, kan der formentlig på sigt opnås en meget stor gevinst ved at bruge gær som produktionsorganisme fremfor de methylotrophe bakterier, der udelukkende er benyttet, siden SCP- produktion omkring 1970 blev industrielt udviklet.
Støkiometrien for en methanbaseret proces er typisk
(4)
Kulstofudbyttet er 0.52 C-atom biomasse/CH4 = 0.8 kg/kg methan.
Dette er langt fra det maksimale udbytte af en anaerob fermenteringsprocess med støkiometrien:
(5)
Her er kulstofudbyttet 3.66 gange større end ved de bakteriebaserede, aerobe processer, der synes enerådende i industrien. Disse er alle hæmmede af den umådeligt ineffektive energi(ATP)skabende proces, hvorved ATP dannes ved ”forbrænding” af en del af substratet. Med en methylotroph gær som Pichia pastoris, der kan danne ATP i en aerob proces ved ”forbrænding” af en del af substratet methanol, kan man formentlig formindske især O2-forbruget (men også C-forbruget) i forhold til de på bakterier baserede processer. Men en forskning i denne retning er sandsynligvis endnu ikke påbegyndt.
Denne artikel fortsætter i næste nummer, hvor fokus vil være rettet mod nytænkning inden for den kemiske industri.
Referencer
To lærebøger [1] og [2] er anvendt til inspiration for de her beskrevne eksempler : Nye ideer kan forbedre både processer og apparatur i bio-industrien. Referencen [3] indeholder yderligere information om hhv. produktion af ravsyre og 1,4 butandiol.
1. Villadsen, J, Nielsen J, og Lidén G (2011). Bioreaction Engineering Principles. 3rd edition, Springer Verlag.
2. Villadsen, J (editor), 2016. Fundamental Bioengineering. Wiley – VCH, Advanced Biotechnology Series, Vol 1.
3. Cok, B, Tsiropoulos, I, Roes, AL, Patel, MK (2014). Succinic acid production derived from carbohydrates. An energy and greenhouse gas assessment of a platform chemical toward a bio-based economy. Biofuels, Bioproducts & Biorefining 8: 16-29.
