Hvad er pektin, hvordan ser det ud og hvordan syntetiseres det? Her beskrives struktur og funktionelle egenskaber samt syntese af skræddersyede nye mikroskopiske og makroskopiske »pektiner«. Pektiner med en hidtil uset høj geleringsevne.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 11, 2002 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Inge Lundt og Robert Madsen, Kemisk Institut, DTU
Tove Christensen og Jørn Dalgaard Mikkelsen, Danisco Innovation
Pektin er et komplekst polysaccharid, der findes i de primære cellevægge i de fleste tokimbladede planter [1,2]. Her er det et af de vigtigste strukturelle elementer, der vha. interaktion og krydsbinding med andre komponenter i cellevæggene giver plantecellerne den karakteristiske form og fleksibilitet. Pektin kan ekstraheres fra mange forskellige planter, men til industrielt brug anvendes der typisk skaller fra citrusfrugter eller æbler. Pektins egenskaber varierer, afhængig af hvilke planter det isoleres fra. Den afgørende forskel mellem de forskellige pektiner skyldes den kemiske struktur og de specifikke funktionelle egenskaber. Det er bl.a. stærkt koblet til molekylvægten og substitutionsmønstret af de enkelte byggestene i pektinen. Sukkerroer indeholder f.eks. et pektin, der er dårligere end citruspektin til at danne geler. Det skyldes at sukkerroepektin har en mindre molekylvægt end citruspektin, ca. 40 kDa i forhold til ca. 100 kDa, at sukkerroepektin er delvist acetyleret, og at indholdet af de forgrenede neutrale sukkerkæder er meget højere i sukkerroepektin end i citruspektin.
Anvendelsesmuligheder
Danmark har en førende rolle inden for produktion af pektin, idet to danske virksomheder har ca. 80% af markedet.
Den udbredte brug af pektin inden for fødevareindustrien og den farmaceutiske industri er baseret på pektins evne til at danne geler. Traditionelt anvendes det som gelerings- og fortykningsmiddel i marmelader, frugtgrød og lignende, men nye anvendelser inden for mejeriprodukter, læskedrikke, bageriprodukter og konfekt samt generelt i »functional foods« er markeder med et stigende potentiale. F.eks. vil nedsættelse af sukkerindholdet i visse føde- og drikkevarer formindske fornemmelsen af »fylde«. Det kan hindres ved at tilsætte pektin. Derfor er pektin også en vigtig ingrediens i diabetikerfødevarer.
For at kunne udnytte og specielt designe pektin til så forskellige anvendelser er det nødvendigt at forstå mekanismerne for geldannelse [3] og de makromolekylære interaktioner, hvilket betyder at kende sammenhængen mellem den kemiske struktur og de funktionelle egenskaber.
Pektins struktur
Pektin er et meget komplekst polysaccharid, der består af lange kæder af D-galacturonsyre-enheder bundet sammen gennem a-1,4-glycosidiske bindinger. Galacturonsyren i naturligt forekommende pektin kan være methyleret op til 74%. De lange kæder af galacturonsyrer kaldes også »homogalacturonan« eller »smooth regions«. »Smooth regions« afbrydes af og til af L-rhamnosemolekyler hvorpå der er forankret sidekæder – de såkaldte »hairy regions«. »Hairy regions« består af en lang række neutrale kulhydrater med L-arabinose og D -galactose som nogle af de vigtigste (figur 1).
Pektin nedbrydes af enzymer (pektolytiske enzymer) i mikroorganismer og planter. Polygalacturonaser katalyserer en hydrolytisk proces, mens pektatlyase spalter ved en b-eliminationsreaktion. Pektinlyaser spalter den glycosidiske binding mellem to methylesterificerede galacturonsyrer ved en b-eliminationsreaktion (figur 2). Desuden findes der methylesteraser og acetylesteraser, der hydrolyserer hhv. methyl- og acetylesterbindingerne.
De pektolytiske enzymer i planterne er involveret i modifikationen af cellevæggene og er sandsynligvis også en vigtig faktor i planternes resistens over for mikrobielle angreb af skadevoldere (fytopatogene organismer). De pektolytiske enzymer kan nedbryde homogalacturonan (»smooth region«, figur 1), hvorved der dannes »oligosacchariner«. Oligosacchariner er betegnelsen for de oligosaccharider, der gennem en kaskade af enzymatiske reaktioner kan inducere resistens over for angreb af fytopatogene organismer. Oligosaccharinerne kan også spille en vigtig rolle i planternes morphogenese og differentiering, såsom celledeling, rod-dannelse og blomstring [4]. De pektolytiske enzymer i mikroorganismer bruges til at nedbryde dødt plantemateriale og dermed til at danne energirige kulhydrater til vækst af mikroorganismerne. De pektolytiske enzymer er også et vigtigt led i patogenese og virulens, når fytopatogene mikroorganismer angriber levende planter.
De pektolytiske enzymer kan oprenses fra mikroorganismer og planter og bruges i laboratoriet til at studere, hvilke specifikke strukturelle elementer i pektin der er nødvendige, for at en enzymatisk spaltning kan finde sted. De kan også bruges til at fremstille forskellige oligomerer af polygalacturonsyrer (pektinfragmenter) ved nedbrydning af pektin. Nedbrydningsprodukterne kan oprenses (se artikel to side xx) og strukturbestemmes (se artikel tre side xx). Men for at få et præcist billede af enzymernes specificitet er det nødvendigt at have adgang til substrater med en kendt struktur. I dette projekt er der for første gang syntetiseret oligogalacturonsyrer, hvor specifikke positioner af carboxylsyrerne er methyleret. Substraterne skal give et detaljeret billede af, hvilke krav de forskellige pektolytiske enzymer har til spaltningsmotivet.
Syntese af oligogalacturonsyrehexamerer
For at polygalacturonaser og pektinlyaser kan nedbryde pektin, er det nødvendigt, at de kan genkende en mindre sekvens af galacturonsyrer. Typisk bindes mellem fire og seks galacturonsyrer i det aktive sted på enzymerne. Det betyder at mindre oligomerer kun vanskeligt kan spaltes af disse enzymer. Derfor skal de fremstillede substrater have en vis længde. På den anden side bliver substraterne vanskeligere at fremstille, jo længere de skal være.
Derfor var målet at fremstille hexasaccharider af galacturonsyre med methylestre i veldefinerede positioner, som både har en tilstrækkelig længde til enzymforsøg, men også er inden for rækkevidde af kemisk syntese.
Designet af forbindelserne sker med udgangspunkt i den viden, som allerede eksisterer om enzymernes substratspecificitet.
Der er i alt fremstillet fem hexagalacturonater 1 – 5 (figur 3) [5,6]. I 1 – 4 findes der en mindre blok af syre- og estergrupper. Meget tyder nemlig på, at polygalacturonaser foretrækker en mindre sekvens af syregrupper for at kunne spalte pektin, mens pektinlyaser foretrækker en sekvens af estergrupper. Stof 5 har en skiftende syre-estersekvens og fungerer som en kontrol, da det ikke skulle være et godt substrat for disse enzymer.
Fremstillingen af 1 – 5 sker ved glycosidsyntese, hvor monosaccharider sammenkobles under dannelse af den ønskede a-1,4-glycosidiske binding indtil et hexasaccharid er opnået. Desværre er galacturonsyre pga. den elektrontiltrækkende syrefunktion ikke særlig reaktiv som koblingspartner. Derfor er galactose blevet anvendt til koblingerne, hvorefter C-6-positionerne er blevet oxideret til syre eller methylester. Afhængig af beskyttelsesgruppen på C-6 kan man vælge, hvor syre- og estergrupperne skal sidde. Alle sekundære hydroxygrupper beskyttes med benzylgrupper, der først fjernes til sidst. Syntesen af 1 er vist i figur 4 [6].
Monosacchariderne 6 – 9 kobles i den viste rækkefølge til hexasaccharidet 14. Benzyletheren i 2-positionen gør, at a-anomeren er hovedproduktet i alle koblingsreaktioner, og ofte ses b-anomeren slet ikke. Først glycosyleres acceptoren 7 tre gange med donoren 6, hvor en chloracetylgruppe fungerer som midlertidig C-4-beskyttelsesgruppe, der fjernes efter hver kobling. Koblingerne gennemføres med pent-4-enylglycosidet, som aktiveres af den stærkt elektrofile N-iodsuccinimid ved tilstedeværelse af en stærk Lewis syre triethylsilyltriflat. Glycosylbromidet 8 kobles til 9 i tilstedeværelse af sølvtriflat, og disaccharidet 13 kobles derefter med tetrasaccharidet 12. Hexasaccharidet 14 har to forskellige C-6-beskyttelsesgrupper, der kan fjernes uafhængigt af hinanden. Først fjernes acetylgrupperne, og positionerne oxideres til methylestre. Derefter fjernes p-methoxyphenylethergrupperne, og der oxideres til syre. Af hensyn til oprensningen beskyttes syrerne som benzylestre. Fjernelse af benzylgrupperne giver herefter 1. Hexamer 2, hvor der er byttet om på methylestrene og syregrupperne i forhold til 1, kan også fremstilles fra 14, idet der byttes om på oxidationerne til methylester og syre. Ved brug af tilsvarende koblings- og oxidationsreaktioner kan hexamererne 3 – 5 også fremstilles. Der er fremstillet ca. 100 mg af hver af disse selektivt esterificerede hexagalacturonater [6].
Pektolytiske enzymers kløvningsmotiv
Hexagalacturonater med definerede methyleringsmønstre er vigtige for bestemmelse af pektolytiske enzymers kløvningssites. I dette projekt er de blevet brugt til at undersøge endo-polygalacturonase og pektinlyase fra Aspergillus.
Produkterne efter nedbrydning af hexagalacturonater med hhv. endo-polygalacturonase og pektinlyase er karakteriseret ved ESI MS (se artikel side xx). For endo-polygalacturonase fra Aspergillus er det vist, at enzymet kun kan spalte glycosidbindingen mellem to ikke-methylesterificerede galacturonsyreenheder. Dvs. at subsite +1 og subsite –1 altid skal være galacturonsyreenheder med frie carboxylsyregrupper. Det sås, at endo-polygalacturonasen har en tydelig præference for glycosidbindingen mellem GalA2 og GalA3 fra den reducerende ende i hexagalacturonat 1. Her kan nedbrydningsprodukterne allerede detekteres efter 1 times fordøjelse med endo-polygalacturonase, mens glycosidbindingen i hexagalacturonat 1 først ses spaltet efter 24 timers fordøjelse. Med hexagalacturonat 3 som substrat sås, at glycosidbindingen mellem GalA2 ogGalA3 og glycosidbindingen mellem GalA3 og GalA4 fra den reducerende ende blev hydrolyseret med samme hastighed af endo-polygalacturonase. Spaltningen af hexamererne viser også, at enzymet kan nedbryde delvist methylerede galacturonsyreoligomerer. ESI MS-analyse af nedbrydningsprodukterne har vist, at endo-polygalacturonase har en høj tolerance for methylgrupper i subsite +2, -2, -3 og -4. Tilsvarende undersøgelser er lavet for pektinlyase. Ud fra spaltningen af hexagalacturonaterne ses det, at enzymet også kan spalte glycosidbindingen mellem en ikke-methylesterificeret galacturonsyreenhed og en methylestergalacturonsyreenhed. Ved at bruge hexagalacturonater med veldefinerede methyleringsmønstre kan man opklare enzymernes specificitet samt kløvningssite og dermed bestemme, hvilken indflydelse methylsubstituenter har på enzymernes substratgenkendelse.
Pektins makroskopiske struktur
Pektins evne til at danne geler er et resultat af interaktion mellem en række frie carboxylsyrer i »smooth region« og Ca2+-ioner. Det betyder, at pektin med en lav methyleringsgrad kan danne stærke geler i nærværelse af Ca2+-ioner. Geler dannes når Ca2+-ioner krydsbinder flere homogalacturonan-kæder. Højt methyleret pektin har for få frie carboxylsyrer til en sådan geleringsmekanisme. Her dannes geler f.eks. ved at tilsætte sukker samt syre (lavt pH). Geleringen består i disse tilfælde af en kompleks blanding af hydrogenbindinger og hydrofobe interaktioner mellem hydroxygrupper i pektinkæden og sukkeret og imellem methylestergrupperne.
Methyleringsgrad bestemt med 1H NMR
Industrielt set er det ønskeligt at kunne designe pektiner med en specifik geleringsevne beregnet til et bestemt formål. Det kræver, at methyleringsgraden let kan bestemmes og varieres efter behov.
NMR-spektroskopi er velkendt til strukturbestemmelse af organiske stoffer. Det er derfor en velegnet analysemetode til kvantitativ bestemmelse af strukturelementer i sådanne molekyler, og det blev undersøgt, om 1H NMR-spektroskopi var velegnet til at bestemme pektinderivaternes methyleringsgrad. Analysemetoden er mindre stofkrævende end den tradionelle, der består af titrering af de frie syregrupper.
Ud fra Grindsted Pectin RS 450 med en methyleringsgrad på 64%, bestemt ved titrering, blev der fremstillet pektin med forskellig methyleringsgrad . Methylering af de resterende carboxylgrupper gav fuldt methyleret pektin (DM= 100%), (DM er »Degree of Methylation«), der efterfølgende blev behandlet med vandig base i forskellige tidsrum [7].
Et 1H NMR-spektrum af råpektin er vist i figur 5. Det ses, at OCH3-signalet, der er indlysende at bruge til bestemmelse af DM, er overlejret med andre kulhydratsignaler. Imidlertid kan man udnytte den forskel, der er på chemical shift af H5-protonen i hhv. galacturonsyrer, der er methyleret, og i de frie syrer/salte. Spektre optages ved pH 7. Delspektret af et pektinderivat er vist i figur 6 sammen med beregning af methyleringsgraden (DM). I figur 7 er der vist eksempler på 1H NMR-spektre med methyleringsgrader fra 8 til 100% DM sammen med råpektin (Starting Pektin, SP med en DM = 63%). Methyleringsgraden blev som kontrol også bestemt ved titrering, og der var fin overensstemmelse mellem DM bestemt ved de to metoder. Hermed er NMR-metoden til bestemmelse af DM demonstreret [7].
Geleringsevnens afhængighed af DM er kendt, og der er hermed udarbejdet en metode til fremstilling af pektinderivater med forskellig geleringsevne. Deres DM bestemmes let ved NMR-spektroskopi.
Fremstilling af nye, stærkt gelerende polymerer
For at opnå pektin med andre egenskaber blev methylesterfunktionerne i råpektin selektivt reduceret med NaBH4 ved pH 7. Herved blev en polymer med 2/3 galactoseenheder pr. galacturonsyreenhed fremstillet (A) (figur 8). De resterende syregrupper blev esterificeret til B. Endelig kunne pektin med DM = 100% reduceres til »poly-galactose« C. Der blev udarbejdet en metode hvor 1H NMR-spektroskopi som før beskrevet kan bruges til at bestemme »graden af reduktion«.
As geleringsevne blev undersøgt. I det modificerede pektin er alle carboxymethoxygrupperne erstattet med primære alkoholgrupper. Rheologiske målinger viste, at evnen til at danne geler var stor, idet det elastiske modulus (G’) var 104 gange højere for A end for råpektin [7].
Råpektins (pektin med en høj DM) geleringsmekanisme er en kompleks blanding af hydrogenbindinger, hydrofobe interaktioner mellem hydroxygrupper og tilsat sukker og mellem methylestergrupperne. Ved at fjerne methylestergrupperne, fjernes de hydrofobe interaktioner, der stabiliseres af sukkeret. I stedet er der dannet alkoholgrupper, der giver meget stærkere hydrogenbindinger, hvorved der er basis for en stærkere geldannelse.
Det er første gang, det er lykkedes at reducere pektin i en præparativ skala og direkte fremstille et pektinderivat, der har en så god geleringsevne [7]. Derfor vil man ved at bruge delvist reduceret pektin i stedet for råpektin kunne erstatte en del sukker i de produkter, der skal geleres.
Med Grindsted pektin RS 450 er det nu muligt at designe pektiner med den ønskede geleringsevne vha. få kemiske reaktioner (figur 9).
Tak
Denne del af centerkontrakten finansierede et ph.d.-stipendium til Mads Clausen (syntese af oligogalacturonsyrer) samt 1 års post.doc.-forløb til Christoph Rosenbohm (NMR-undersøgelser samt »designer pektin«). Tak til dr. Niall Young, Danisco, Brabrand, for at udføre de rheologiske målinger og til dr. Jacques Benen, Wageningen Agricultural University, Holland, for at have udført endo-polygalacturonaseanalyserne.
1. Thakur B.R.; Singh R.K.; Handa, A. K. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 1997, 37, 47-73.
2. Voragen A.G.J.; Pilnik W.; Thibault J.F.; Axelos M.A.V.; Renard C.M.G.C. Pectins. In Food Polysaccharides and their Applications. Stephen A. M. (Ed.); Marcel Dekker, Inc.: New York 1995, pp. 287-339.
3. Oakenfull D.G. (2000). Solvent structure and gelation of polysaccharides in concentrated solutions of simple sugars. In Gums and stabilisers for the food industry; Williams P.A.; Phillips G.O.; The Royal Society of Chemistry: Cambridge, 2000; Vol. 10, pp. 277-284.
4. Albersheim P.; Darvill A.; ugur C.; Cheong, J.-J.; Eberhard S.; Hahn M. G.; Marfa V.; Mohnen D.; O’Neill M. A.; Spiro M. D.; York W. S. Acc. Chem. Res. 1992, 25, 77-83.
5. Clausen M. H.; Jørgensen M. R.; Thorsen J.; Madsen R. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 2001, 543-551.
6. Clausen M. H.; Madsen R. submitted.
7. Rosenbohm C.; Lundt I.; Christensen T. M. I. E.; Young N. W. G. Carbohydr. Res. 2002, accepted.
Figur 1. Kemisk sammensætning af pektin.
Figur 2. Nedbrydning af pektin med pektolytiske enzymer.
Figur 3. Fremstillede hexagalacturonater med methylestre i veldefinerede positioner.
Figur 4. Syntese af hexagalacturonat 1. Reagenser: (a) N-iodsuccinimid, Et3SiOTf; (b) thiourinstof; (c) AgOTf; (d) (i) NaOMe, (ii) Dess-Martin reagens, (iii) NaClO2, (iv) Me3SiCHN2; (e) (i) (NH4)2Ce(NO3)6, (ii) Dess-Martin reagens, (iii) NaClO2, (iv) PhCHN2; (f) H2, Pd/C.
Figur 5. 1H NMR-spektrum af råpektin i D2O. Toppe markeret med · er reference [(CH3)3Si(CH2)3SO3- Na+].
Figur 6. Bestemmelse af methyleringsgrad (Degree of Methylation, DM) vha. 1H NMR-spektroskopi.
Figur 7. 1H NMR-spektre af pektinderivater med forskellig methyleringsgrad.
Figur 8. Selektiv reduktion af pektin
a) NaBH4, imidazol, HCl, pH=7, H2O, 16 timer, 0°C
b) MeOH, AcCl, 2 døgn, 5°C.
Figur 9. Fremstilling af modificerede pektiner med ønsket geleringsevne.
