Traditionel metodeudvikling er ofte tidskrævende. Ved udvikling af en omvendt fase HPLC-metode til melperon er traditionel metodeudvikling sammenlignet med udvikling vha. modelleringsværktøjerne MODDE og DryLab.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 10, 2004 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af David Elsner, Lars Lauritzen, Jette Tjørnelund, H. Lundbeck A/S
Melperon fremstilles hos H. Lundbeck A/S i to formuleringer, som tablet og injektionsvæske i ampul. Handelsnavnet er Buronil, og rettighederne er for nylig solgt til Ovation Pharmaceuticals, Inc.
Buronil findes som 10, 25 og 50 mg tablet og 25 mg/mL injektionsvæske konserveret med benzylalkohol, og det er et højdosis antipsykotikum.
Hos Lundbeck skulle udvikles en ny omvendt fase HPLC-metode til melperon-assay og urenhedsanalyse (strukturer i figur 1).
Der blev opstillet en række ønsker til den nye analysemetode (tabel 1). Ud over disse konkrete krav var det målet at sammenligne de to kommercielt tilgængelige modelleringsværktøjer DryLab og MODDE med den mere traditionelle manuelle fremgangsmåde, hvor en parameter testes ad gangen. Værktøjernes brugbarhed til optimering af analysemetoden skulle endvidere vurderes.
Screening
Som udgangspunkt for screeningen af metoden blev de to kolonnetyper XTerra C-8 og Symmetry C-18 valgt. Begge kolonner har lav silanolaktivitet, hvilket gør toppene smallere (reducerer tailing). Korte kolonner (hhv. 100×3 mm og 75×4,6 mm) med lille partikelstørrelse (3,5 µm) blev valgt for at minimere analysetiden og opnå god separation. I figur 2 ses k’ (faktaboks 1) for stofferne analyseret på Symmetry C-18 ved forskellige acetonitrilkoncentrationer (ACN) med isokratisk eluering. Det fremgår, at melperon er væsentligt mere påvirkelig af ændringer i ACN-koncentrationen. Forløbene af kurverne ligner det for XTerra C-8 (ikke vist), men der er dårligere separation af benzaldehyderne og mindre plads til melperon mellem benzylalkohol og benzaldehyd. Methanol blev også afprøvet som organisk fase, men gav generelt dårligere resolution end med ACN (ikke vist).
Som udgangspunkt for optimeringen blev Symmetry C-18 valgt som stationær fase, og acetonitril (15–20%v/v) i phosphatbuffer blev valgt som mobilfase med isokratisk eluering.
Optimering – manuel
Under den manuelle del af optimeringen blev parametrene i tabel 2 testet i de angivne intervaller. I figur 3 ses igen, hvor påvirkelig melperon er af koncentrationen af den organiske fase, da resolutionen (Rs) mellem melperon og dets to nabotoppe hurtigt ændres. Resolutionen mellem de andre toppe ændres væsentligt mindre og udviser en faldende trend med stigende ACN-koncentration. Det ses, at imellem 15 og 20%v/v ACN er benzaldehyderne de kritiske toppe med minimal resolution på 3–3,5. Det er også det mest robuste interval, da den minimale Rs er næsten konstant og det ønskede mål på 2,0 er opfyldt. Retentionstiden for den sidst eluerede top er under 10 min, hvilket også opfylder det ønskede. De fastlagte parameterværdier fra den manuelle optimering er vist i tabel 2.
Optimering – automatiseret
Design of Experiments
MODDE blev afprøvet til screening og optimering af parametrene. I tabel 3 ses 7 parametre, og de intervaller der er benyttet til »design of experiments« i MODDE, hvor en simpel lineær model med 8 forsøg ved de angivne betingelser blev valgt.
Screening af de enkelte parametres signifikans for resolutionen mellem toppene er vist i figur 4, hvor de skalerede og centrerede koefficienter for de enkelte parametre er vist for hver resolution. Det ses bl.a. i figur 4,1, at for benzylalkohol- og melperontoppene har acetonitrilkoncentrationen, temperaturen samt antal injektioner (kolonne k1 har været udsat for mange injektioner) negativ effekt på resolutionen. Bufferkoncentrationen, pH og antal injektioner (k2 har været udsat for færre injektioner) har positiv effekt på resolutionen. De resterende parametres injektionsvolumen og dummyanalyse (blank, normal) har ingen effekt på resolutionen. Det var som forventet, da der ellers ville være noget grundlæggende galt med metoden eller udstyret. Antal injektioner, kolonnen har været udsat for, har stor indflydelse på resolutionen mellem flere af toppene. Forringelsen i resolution skyldes primært, at toppenes facon ændres og bliver bredere. Melperons afhængighed af bufferkoncentrationen blev undersøgt nærmere manuelt. Melperon skifter retentionstid fra 1,8 til 4,4 min, når koncentrationen ændres fra 2,5 til 50 mM, hvor de andre toppe ligger konstant (ikke vist).
I figur 5 ses fire ekstrapolerede konturplots af MODDE, hvor resolutionen mellem toppene er vist som funktion af ACN-koncentrationen og temperaturen. Det ses, at det optimale findes som et kompromis omkring 16 –17%v/v ACN som under den manuelle optimering. Rs er svagt faldende ved stigende temperatur. Den af MODDE beregnede optimale kombination af værdierne af parametrene er 16%v/v ACN, 26 mM phosphatbuffer, pH 3,04 og en temperatur på 46oC. De ligger tæt på de endelige fastlagte værdier vist i figur 8.
Modellering
Det andet benyttede modelleringsværktøj var DryLab og i figur 6 ses en simulering i DryLab baseret på fire kalibreringsforsøg, af hvordan resolutionen afhænger af ACN-koncentrationen og temperaturen – der er maksimal resolution mellem 15,0 og 19,5%v/v ACN (rødt område). Intervallet er det mest robuste, da Rs kun ændres marginalt ved ændringer i ACN-koncentrationen, som også blev vist manuelt. Ved stigende temperatur er resolutionen svagt faldende (som vist med MODDE). I figur 7 er toppene i kromatogrammet simuleret i DryLab ved 16%v/v ACN og 45°C. Der ses en god overensstemmelse mellem det simulerede og det reelle ved sammenligning med kromatogrammet i figur 8.
Konklusion
Kromatogram og parameterværdier er vist i figur 8, og de resulterende resolutioner er vist i tabel 5. Det ses, at metoden opfylder de opstillede ønsker i tabel 1. De vigtigste punkter er, at metoden er isokratisk, analysetiden er på under 10 min, og den minimale resolution er på 3,7. Det er et robust område, hvor små ændringer ikke påvirker Rs væsentligt. Derudover kan metoden bruges til assay og urenheder/nedbrydning ud fra den samme prøveoparbejdning og til både tabletter og ampuller.
Det blev vist, at MODDE og DryLab er gode og brugbare modelleringsværktøjer, der kan reducere antallet af nødvendige analyser under optimeringen betragteligt (tabel 4). MODDE viste sig specielt egnet til screening af mange parametre på få eksperimenter. MODDE viste de samme trends under optimeringen som DryLab og den manuelle fremgangsmåde, men da det var en simpel model, var den mere upræcis. DryLab krævede flere analyser, men gav også en mere præcis kromatografisk simulering ved sammenligning med den manuelle fremgangsmåde.
Samlet set er MODDE i vores tilfælde mest velegnet til at give et hurtigt overblik, hvor DryLab er mere egnet til den mere forfinede optimering, hvor de sidste detaljer fastlægges.
Tabel 1. Ønsker til ny omvendt fase HPLC-analysemetode.
Figur 1. Strukturformler af melperon (intern standard) og dets UV-detekterbare nedbrydningsprodukter 4-fluorbenzaldehyd og 4-fluoracetophenon samt konserveringsmidlet benzylalkohol til injektionsvæsken og dets nedbrydningsprodukt benzaldehyd.
Faktaboks 1. Definition af parametre.
Figur 2. Screening af k’ for stofferne i tabel 1 ved forskellige acetonitrilkoncentrationer for Symmetry C-18 (k1) (75×4,6 mm, 3,5 mm) ved 45oC, inj. vol. 5 µl, 1,5 ml/min, 20 mM phosphatbuffer pH 3,0. Alle k’ er bestemt med isokratisk eluering.
Figur 3. Resolution Rs som funktion af acetonitrilkoncentrationen (%v/v) mellem de angivne toppe. Symmetry C-18 kolonne (k1), 45oC, 1,5 ml/min inj. vol. 5 µl og 20 mM phosphatbuffer pH 3,0. Alle Rs er bestemt med isokratisk eluering.
Tabel 2. Optimeringsparametrene og intervaller testet under den manuelle optimering og de endeligt fastlagte parameterværdier.
Tabel 3. Parametre og intervaller til »design of experiments« i MODDE. Den lineære model Fractionel Factoriel Resolution III er brugt (8 eksperimenter).
Figur 4. MODDE koefficientplot for Rs mellem 1: benzylalkohol – melperon, 2: melperon – benzaldehyd, 3: benzaldehyd – 4-fluorbenzaldehyd samt 4: 4-fluorbenzaldehyd – 4-fluoracetophenon.
Figur 5. MODDE ekstrapolerede konturplots af resolutionen Rs som funktion af acetonitrilkoncentrationen (%v/v) og temperaturen (oC) ud fra forsøgsopstillingen i tabel 3.
A: Rs mellem benzylalkohol og melperon. B: Rs mellem melperon og benzaldehyd. C: Rs mellem benzaldehyd og 4-fluorbenzaldehyd. D: Rs mellem 4-fluorbenzaldehyd og 4-fluoracetophenon.
Figur 6. DryLab 3-D minimum resolutionsplot. Den minimale Rs er plottet (farver) som funktion af acetonitrilkoncentrationen (%v/v) og temperaturen (oC) på Symmetry C-18 (k2). Beregnet ud fra 4 kalibreringseksperimenter ved 14–18%v/v ACN og 40–50oC, hvor 1,5 ml/min, 25 mM phosphatbuffer pH 3,0 er benyttet.
Figur 7. DryLab simuleret kromatogram. 16%v/v ACN, 25 mM phosphatbuffer pH 3,0, 45oC, 1,5 ml/min.
Tabel 4. Styrker og svagheder ved hver optimeringsmetode og antal forsøg pr. parameter.
Tabel 5. Data til kromatogram af endelig metode vist i figur 8.
Figur 8. Kromatogram for endelig HPLC-metode, Symmetry C-18, 16%v/v ACN, 25 mM phosphatbuffer pH 3,0, 45oC, 1,5 ml/min, inj. vol. 5 µl, 254 nm.
